牛乳鐵蛋白(LTF)ELISA實驗說明

檢測范圍：

2ng/ml -100 ng/ml

使用目的：

本試劑盒用于測定牛血清、血漿及相關(guān)液體樣本中乳鐵蛋白(LTF)含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中牛乳鐵蛋白(LTF)水平。用純化的牛乳鐵蛋白(LTF)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入乳鐵蛋白(LTF)，再與HRP標(biāo)記的乳鐵蛋白(LTF)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹-底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的乳鐵蛋白(LTF)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中牛乳鐵蛋白(LTF)濃度。

標(biāo)本要求

1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

100ng/ml 5號標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

50ng/ml 4號標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

25ng/ml 3號標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

12.5ng/ml 2號標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

6.25ng/ml 1號標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

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